一、检测适用人群

• 无精子症患者
• 严重少精子症患者，精子浓度＜2×10⁶/mL为核心检测人群，浓度2-5×10⁶/mL可酌情检测
• 无精子症拟行睾丸精子提取术（TESE）患者
• 合并非特发性不育相关疾病（睾丸肿瘤、附睾梗阻、睾丸炎、精索静脉曲张、放化疗后）且伴无精子症/严重少精子症的患者
• 精索静脉曲张伴无精子症/严重少精子症患者，术前需筛查
• 无需检测人群：染色体异常（除外46,XY/45,X核型）、梗阻性无精子症（FSH正常）、低促性腺激素性性腺功能减退、克氏综合征患者

二、诊断检测核心原则

• 首选检测方法为Y染色体特定区域PCR扩增
• 标记物核心要求：对应仅在无精/少精男性中特异性缺失的Y区域

三、缺失类型与临床表型关联

3.1 完全AZF缺失

• AZFa完全缺失：792kb，累及USP9Y、DDX3Y基因，对应唯支持细胞综合征，表现为无精子症
• AZFb完全缺失：6.2Mb，累及32个转录单位，表现为无精子症，多为唯支持细胞综合征或生精阻滞
• AZFc完全缺失：3.5Mb，累及21个转录单位，表现为无精子症或严重少精子症，部分患者存在残余生精功能
• AZFbc完全缺失：7.0-7.7Mb，累及38-42个转录单位，表现为无精子症
• 频率排序：AZFc（70%-80%）＞AZFbc（1%-20%）＞AZFb（1%-7%）＞AZFa（0.5%-9%）

3.2 部分AZF缺失

• 部分AZFa缺失：多为USP9Y基因缺失，表型从无精子症到正常精子计数不等，DDX3Y功能缺失为AZFa区生精障碍核心原因
• gr/gr部分AZFc缺失：删除一半AZFc基因内容，为人群特异性生精损伤风险因素，可使生精障碍风险升高1.8-2.5倍，同时为睾丸生殖细胞肿瘤易感因素，表型从无精子症到正常精子计数不等

四、检测方法与更新要点

• 核心检测方案：基础多重PCR+缺失扩展分析为金标准
• 引物更新：sY84引物的正、反向序列均更新，避免引物错配及覆盖亚洲人群SNP位点
• 标记物更新
  • AZFa近端边界仅推荐sY1064，不再使用sY83
  • AZFb远端边界仅推荐sY1192，不再使用sY143，可区分完全/部分AZFb缺失，评估TESE预后
  • AZFb近端检测推荐先使用sY121，若sY121缺失再加测sY1224
• 商用试剂盒提示：目前尚无商用试剂盒匹配更新后的首选缺失扩展分析标记物，部分试剂盒检测标记过多不推荐使用
• gr/gr缺失检测：是否检测由实验室及临床医师自行决定
• 质量控制：强烈建议每年参加外部质量评估项目

五、各区域缺失检测方案

5.1 AZFa区域检测

• 基础标记物：sY84、sY86
• 缺失扩展分析：
  • 近端边界：sY82（存在）、sY1064（缺失），推荐用sY1064替代旧版sY83
  • 远端边界：sY1065/ sY1182（缺失）、sY88（存在）
• 单标记物缺失时需按参考图谱或数据库进一步分析

5.2 AZFb区域检测

• 基础标记物：sY127、sY134
• 缺失扩展分析：
  • 近端边界：sY105（存在）、sY121/sY1224（缺失）
  • 远端边界：sY1192（缺失）、sY153（存在），优先用sY1192替代旧版sY143
• 禁用标记物：sY114、sY152，不存在所谓“AZFd”区域，不建议使用包含该区域的试剂盒

5.3 AZFc区域检测

• 基础标记物：sY254、sY255，二者同时缺失可确诊完全缺失，单标记物缺失考虑为技术错误
• 缺失扩展分析：用sY160区分完全AZFc缺失（sY160存在）和末端缺失（sY160缺失），末端缺失需加做核型分析
• gr/gr部分缺失检测：标记物为sY1291（缺失）、sY1191（存在），亚洲患者需加做Y单倍群分析排除谱系固定缺失

5.4 AZFbc区域检测

• 基础诊断：sY127、sY134、sY254、sY255均缺失
• 亚型区分：用sY116判断缺失模式，sY116存在为P4/远端P1型，缺失为P5/远端P1型
• 推荐加做sY160识别末端缺失

六、PCR反应设置与质量控制

6.1 质控要求

• 每次反应同步设置三类对照：正常男性DNA阳性对照、女性DNA对照、无DNA水空白对照
• 必须包含两种内参：SRY基因标记物sY14、ZFX/ZFY基因标记物

6.2 引物选择

• 基础检测每区域至少选2个STS位点，推荐基础引物：AZFa选sY84、sY86；AZFb选sY127、sY134；AZFc选sY254、sY255
• 亚洲样本若sY84扩增失败，需更换备用引物或邻近标记物

七、结果解读与复测规则

• 单AZFc标记物缺失判定为技术错误
• AZFa或AZFb仅单标记物缺失时，需先验证再详细分析整个区域
• 结果模糊或怀疑技术失败时，优先重复多重PCR，结果仍不一致则改用单重PCR、降低退火温度复测，直至结果清晰可重复
• 避免引物反复冻融导致扩增失败

八、检测报告规范

• 通用要求：标准化格式、非专业人员可理解，禁用手写报告，包含转诊医生信息、检测实验室完整信息、报告编号、转诊及报告日期、患者完整身份信息、检测样本类型、易懂的解读与结论、至少两名评估者签名、明确页码
• 检测相关内容：明确转诊原因与检测指征、检测方法及局限性，使用商用试剂盒需标注名称、厂商及版本，外送检测需明确说明，标记物结果用“存在/缺失”等文字表述，避免使用“+/-”符号

九、替代检测方法要求

• 标准方案：两步法多重PCR+必要的缺失扩展分析为性价比最高、可重复性最好的首选方案
• 其他方法注意事项：
  • 多数商用试剂盒标记物过多易导致假阳性，且多数不支持单PCR验证
  • 基因特异性标记物、毛细管电泳、实时荧光定量PCR、MLPA、芯片、二代测序等方法仅可在充分验证敏感性、特异性后使用，报告需明确标注具体方法，不可标注“符合指南”
  • 二代测序用于临床诊断需充分验证，避免因Y染色体结构变异导致诊断错误

十、外部质量评估要求

• 推荐实验室参与EAA/EMQN的年度AZF检测室间质评计划，质评样本需与临床样本同流程处理
• 该质评计划可有效降低基因分型错误率，提升报告解读质量，目前诊断错误率已降至1%-2%
• 过多非必要标记物是报告解读错误的常见原因

十一、检测预后价值

• AZFa完全缺失：TESE取精成功率几乎为0，不推荐行TESE
• AZFb完全缺失（sY1192阴性、P5/近端P1缺失）：TESE取精成功率几乎为0，不推荐行TESE；部分AZFb缺失或近端断点位于P4的非典型AZFbc缺失可尝试TESE，存在取精成功可能
• AZFc完全缺失：无精子症患者TESE取精成功率约50%（15%-71%），外周血45,X细胞系比例＞5%为取精阴性预测因素

十二、遗传咨询要点

• 遗传风险：若可获得精子，AZF缺失会100%传递给男性后代，后代生精功能受损风险高，具体表型无法预测
• 辅助生殖结局：AZFc完全缺失仅可能降低受精率，胚胎质量、临床妊娠率、流产率、活产率与无异常人群无显著差异
• 后代健康：现有数据显示出生后代多数表型正常，目前无特纳综合征、外生殖器畸形相关报道，但仍缺乏大样本长期随访数据
• 额外检测推荐：AZFc完全缺失或Yq末端缺失患者，推荐行100个中期细胞的核型分析，排除46,XY/45,X嵌合
• 家系筛查：AZFc完全缺失、部分AZFb/部分AZFa缺失患者，建议对家系男性成员进行筛查；AZFa、AZFb、AZFabc完全缺失无需家系筛查